一、什么是慢病毒包装？
慢病毒（Lentivirus，LV）属于逆转录病毒科（Retrovirus），是一种球形包膜病毒，直径约80-120nm。其基因组是含两个拷贝的单股正链RNA，包含在由酶促蛋白核衣壳（NC）、衣壳（CA）、逆转录酶（RT）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）组成的核心内，核心被基质蛋白（MA）的蛋白质层包围。包膜蛋白（ENV）嵌入病毒粒子脂质包膜中，它与靶细胞受体结合并介导病毒粒子进入。基因组两端是长末端重复序列（LTR），它能够让慢病毒的基因组整合到宿主基因组中转录比较活跃的位点，而且它含有强启动子和增强子。那么如果我们人为地把LTR之间的序列替换成我们的目的基因序列，在病毒感染过程中，慢病毒的基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的逆转录酶逆转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰，可随宿主细胞分裂传递给子代细胞，还能够稳定地在细胞内表达。
由于在一些细胞相关实验中，有些细胞难以用常规方法转染，通常通过慢病毒感染的方式将靶基因随机整合到宿主的基因组中，从而增加转染效率，并且能够在细胞系中稳定表达若干代，可进行稳定细胞株的筛选。目前，慢病毒已广泛用于基因功能研究、RNA干扰、小分子RNA研究以及活体动物实验中，成为基因治疗的有力工具之一。
二、慢病毒包装的原理
携带外源基因的慢病毒载体与包装载体一同转染包装细胞，即可进行病毒的包装。包装好之后分泌到细胞外的培养基中，经过离心取得上清液，再浓缩后的慢病毒液可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过逆转录，整合到细胞基因组，从而实现外源基因在宿主细胞中的表达。
三、慢病毒载体
目前实验室应用z广泛的慢病毒载体（Lentiviral vectors，LVs）是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的载体，其中HIV-1/HIV-2系统已得到了广泛应用。要想包装出一个完整病毒，我们一般需要如下几个质粒：（1）一个转移质粒；（2）一个或两个包装质粒；（3）一个包膜质粒。
（1）转移质粒：包含用于复制/转录和包装的顺式作用序列。其中包含的启动子可促使任何感兴趣的基因均以细胞类型特异性或非特异性方式表达。
（2）包装质粒：提供结构和RT蛋白（Gag-Pol）。
（3）包膜质粒：编码一种糖蛋白来假型化载体颗粒，该过程包括在病毒脂质包膜中掺入异源ENV。z常用的ENV之一是水疱性口炎病毒糖蛋白（VSV-G），其赋予载体稳定性以及广泛的细胞趋向性。
四、慢病毒包装的实验步骤
（1）构建含有目的基因的慢病毒载体。
（2）大量扩增慢病毒载体：根据实验将包装慢病毒过程中需要用到的3个质粒进行高纯度无内毒素抽提。
（3）293T细胞内进行慢病毒载体的大量包装：按一定比例将转移质粒、包装质粒和包膜质粒共转染指数生长期的293T细胞。
（4）慢病毒的浓缩及纯化：PEG8000浓缩法/蔗糖密度梯度超速离心法。
（5）慢病毒滴度测定：采用GFP荧光计数、绝对定量qPCR和RT-qPCR等进行慢病毒滴度测定。
五、慢病毒包装优势
1、感染谱广：大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因可在不同的组织或细胞中包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等长期表达。
2、稳定表达：相比瞬时转染，慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，并且可以稳定持续表达。
3、适用范围广：不仅能用于体外实验，还能用于活体动物模型，尤其是动物成瘤实验。
4、免疫原性低：慢病毒载体不表达任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位无细胞免疫反应，体液免疫反应也较低，不影响病毒载体的第2次注射。
六、慢病毒包装过程中的常见问题
1、如何计算需要加入的病毒量？
通过MOI计算。MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高，证明细胞越难被感染。一般我们把某株细胞有80%被感染时所用的病毒颗粒数和细胞数目的比值作为该株细胞的MOI。
相关计算公式：
每孔所加病毒量（μL）=MOI×细胞数/病毒滴度（TU/mL）×1000
MOI=（病毒滴度×病毒体积）/细胞数目
病毒滴度可通过荧光计数法进行确定。
2、慢病毒感染细胞，铺板密度是多少？
通常根据细胞增殖的速度调整细胞铺板密度，以保证在感染后3天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。
针对大部分细胞系：传代周期在2~3天，感染时细胞铺板的密度保持在30~50%左右；
针对某些原代细胞：由于细胞增长缓慢，可以在接种时提高汇合度到70~80%左右；
针对非分裂细胞：如神经元细胞，接种后不再增殖，此时可以按照100%的汇合度进行接种。
3、向细胞中加入慢病毒的z佳时间是什么时候？
一般慢病毒感染细胞后可在2~3天观察到所携带基因的荧光表达情况，即在细胞状态良好，汇合度为30~50%时加入慢病毒，以确保在感染后2天时细胞增长达到70%左右的汇合度，即是z佳时间。
4、慢病毒感染细胞后基因表达多久到达峰值？
慢病毒感染后大部分细胞GFP或目的基因的表达在3天左右达到峰值，但若是细胞生长缓慢，达到峰值的时间就会延长。
5、慢病毒感染细胞后为什么GFP荧光信号弱？
一般与进入宿主细胞内慢病毒颗粒数较少、自身的增殖状态较差、细胞种类、观察时间较早、目的基因表达或者特殊结构等因素有关。一般慢病毒感染细胞3天左右荧光信号z强。
6、慢病毒包装出毒量很低？
可能与以下几个方面有关：
（1）细胞状态：一般293T细胞的活力、增殖状态、铺板密度、是否处于对数生长期等对病毒的产量影响很大。
（2）质粒提取的质量：若出现纯度不高、浓度过低、未去除内毒素、目的基因载体构建的不完整等均会导致包装出毒量很低。
（3）目的基因：目的基因的片段大小、序列及翻译的蛋白是否含有毒性均会影响包装效果。目的基因片段过大（＞2.5k）可能会导致包装滴度下降，甚至无法包装。目的基因翻译的蛋白产生细胞毒性，可能会导致细胞增殖异常以至于包装出毒量很低。
（4）收毒时间：收毒时间过早，会导致出毒量很低。一般在转染后24h观察细胞生长状态和荧光信号强弱，若细胞生长状态良好，第一次可在48h收集病毒上清，第二次可在换液后72h收集病毒上清。
7、慢病毒感染细胞效率低？
可能与以下因素有关：
（1）细胞类型：某些原代细胞和干细胞自身较难转染，导致慢病毒感染细胞效率低，可加大病毒量或采用浓缩病毒进行感染。
（2）细胞生长状态：细胞感染前生长状态异常，如存在支原体污染、细胞铺板密度过大等。
（3）病毒质量：慢病毒滴度不高，操作时应尽量避免冻融，建议分装储存于-80℃。
